肿瘤坏死因子α通过RhoA-ERK信号通路调控人脐静脉内皮细胞单层通透性的实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层通透性改变的效应分子,以寻找内皮细胞损伤修复的有效治疗靶点。方法应用TNF-α刺激体外培养的HUVEC,观察HUVEC骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组织化学和Westernblot方法检测TNF-α刺激前后细胞中RhoA和MAPK信号通路的改变。并通过添加特异性分子抑制剂Y27632和PD98059阻断RhoA和ERK表达,观察细胞F-actin及细胞单层通透性的改变。进一步应用持续活化型RhoA和主导抑制型RhoA逆转录病毒分别感染改变人HUVEC,改变细胞中RhoA的活化状态,观察TNF-α刺激前后细胞骨架蛋白及单层细胞通透性的变化。并确定RhoA与FRK的相互作用。结果 TNF-α刺激引起HUVEC中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强,呈现时间和剂量依赖性趋势。其中TNF-α(100ng/ml)刺激2h后细胞单层通透性最强,HRP-BSA渗漏最大浓度为40ng/ml。同时,细胞中活化RhoA的表达明显增加。TNF-α刺激前后细胞中MAPK信号转导蛋白JNK、P38和ERK1/2总蛋白均无明显改变,但p-JNK、p-p38和p-ERK表达均显著增加。其中,应用Y27632抑制RhoA的活化或PD98059阻断p-ERK表达后,TNF-α刺激的HUVEC中F-actin重构现象消失,同时细胞单层通透性增加也受到明显抑制,HRP-BSA渗漏浓度从40ng/ml下降至12.5ng/ml(P<0.05)。进一步应用持续活化型RhoA感染人HUVEC细胞,发现RhoA活化的HUVEC单层通透性明显高于GFP感染组,HRP-BSA在TNF-α(100ng/ml)刺激2h后渗漏浓度从达到50ng/ml(P<0.05),同时p-ERK表达也明显增加。而应用TNF-α刺激后,抑制型RhoA感染的HUVEC的骨架蛋白与单层细胞通透性均无明显变化。同时,p-ERK活化也受到明显抑制。结论 RhoA-pERK通路的活化介导了TNF-α诱导的HUVEC通透性增加,特异性抑制RhoA-ERK通路可以阻断TNF-α引起的内皮细胞通透性增加。