神经干细胞共移植体的体外构建

目的:选择合适的细胞外基质,利用脑微血管内皮细胞、细胞外基质与神经干神胞构建神经干细胞共移植体,以提高移植神经干神胞向神经元的分化率。方法:实验于2005-11/2006-10在佳木斯大学神经病研究所免疫组织化学研究实验室完成。①实验材料:同一基因背景出生2h～7d清洁级Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供。取出生24h内Wistar大鼠大脑制备神经干细胞,采用免疫组织化学法和免疫荧光法做nestin染色鉴定;取出生1～7d Wistar大鼠大脑制备脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。②实验方法:不同细胞外基质的筛选:将多聚赖氨酸、层黏连蛋白和Matrigel分别与神经干细胞和脑微血管内皮细胞混合培养,接种于铺有盖玻片的6孔板中,并加入神经干细胞完全培养液,每3d换半量液,7d换全液。采用免疫组织化学观察抗微管相关蛋白阳性细胞。进行神经干细胞共移植体构建及检测。③实验评估:利用免疫荧光方法,以Ⅷ因子标记物标记脑微血管内皮细胞,用nestin标记神经干细胞,检测共移植体。结果:①神经干细胞和脑微血管内皮细胞形态学观察及鉴定:原代分离的单神经干细胞4d增生为神经细胞球,传代后,经nestin免疫荧光染色,细胞球呈阳性;原代培养脑微血管内皮细胞6～8d长满瓶壁,细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形,Ⅷ因子相关抗原阳性。②3种细胞外基质对神经干细胞分化的影响:层黏连蛋白与两种细胞共培养,抗微管相关蛋白阳性细胞数明显高于Matrigel组和多聚赖氨酸组(P<0.01)。③共移植体活细胞镜下及免疫荧光结果所见:镜下可见共移植体细胞团不规则,神经干细胞被脑微血管内皮细胞包绕或相互连贴,脑微血管内皮细胞核大,胞体不规则,明显大于神经干细胞,神经干细胞折光性强。在200倍视野下,随机选取100个共移植体进行细胞计数,可见平均细胞数为8～15个,其中脑微血管内皮细胞数平均2.8个。免疫荧光可见红色Ⅷ因子阳性脑微血管内皮细胞包被绿色nestin阳性神经干细胞,或相互粘贴。结论:以脑微血管内皮细胞为支持细胞,用层黏连蛋白为细胞外基质可以成功构建神经干细胞共移植体。