逆转录病毒介导的人CNTF在嗅神经鞘细胞中的表达及其对神经细胞存活和突起生长的影响

目的　研究含有睫状神经营养因子 (CNTF)表达调控系统修饰的嗅神经鞘细胞 (OECs)对神经细胞存活和突起生长的影响。　方法　通过基因克隆 ,用KpnⅠ +XbaⅠ将pcDNA3 S(NGF信号肽 ) hCNTF质粒中含有NGF信号肽的CNTF切下 ,插入逆转录病毒表达载体pRev TRE中。酶切鉴定后 ,将其与本系统的调控质粒pRev Tet On转入Ecopack 2 93细胞进行病毒包装 ,制备重组缺陷型hCNTF和Tet On逆转录病毒感染原代培养的大鼠OECs,用不同浓度的强力霉素诱导 ,以Western blot法对hCNTF的表达培养上清进行检测。将转染hCNTF的OECs与新生 2d大鼠DRG联合培养 ,用其上清培养视网膜节细胞 (RGCs)。经 β tubulin免疫组织化学染色后 ,分别测量DRG神经突起的长度并统计阳性RGCs数目。　结果　 1 经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定 ,pRev TRE S hCNTF重组体分别被切下 6 30bp和 4 0 0bp片段 ,插入子的方向和完整性经确认与预期相符。 2 以不同浓度强力霉素诱导hCNTF修饰的OECs ,其培养上清均有分子量约 2 4kD的hCNTF蛋白质的显著特异表达 ,此表达与强力霉素的浓度呈正相关。未诱导组和对照组未见明显蛋白带。 3 同单纯OECs(2 3 15± 4 7)、空载 (2 4 5 5± 5 8)、空白 (16 8± 6 5 )等对照组相比 ,经hCNTF转染的OECs上清组的存活RGC数显著