成人骨髓间充质干细胞的鉴定与体外BrdU标记

背景:目前尚未发现骨髓间充质干细胞独有的标志分子,给其鉴定带来一定困难。BrdU标记不存在放射性污染,有研究认为在不受到紫外线照射的条件下,BrdU标记后对细胞功能无损害。目的:探讨成人骨髓间充质干细胞体外鉴定和标记的方法,并观察其生物学特性。设计、时间及地点:细胞观察,于2007-06/12在解放军兰州军区兰州总医院完成。材料:成人骨髓来自5例健康志愿者。BrdU为美国Sigma公司产品。方法:采集成人骨髓10mL,密度梯度法分离单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,调整细胞密度为2×108L-1进行扩增培养。取第3代骨髓间充质干细胞,加入成骨诱导培养基,行碱性磷酸酶染色;加入成脂诱导培养基,行油红O染色;加入终浓度为5,10,15μmol/LBrdU溶液,孵育12,24,48,72,96h后行免疫细胞化学染色。主要观察指标:倒置光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪鉴定细胞表型,成骨及成脂诱导分化结果。BrdU阳性标记率及标记后细胞生长情况。结果:①体外培养的成人骨髓间充质干细胞形态均一,为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观;表达CD44和CD71,不表达CD34和HLA-DR;可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。②大部分骨髓间充质干细胞标记后核抗BrdU染色阳性,随着标记浓度的升高和标记时间的延长,BrdU阳性率逐渐增高,终浓度10μmol/LBrdU标记72h后阳性率达90%以上,且连续传9代均可检测到BrdU阳性细胞。第3代骨髓间充质干细胞90%处于G0/G1期,BrdU标记后88.62%处于G0/G1期,标记前后细胞生长周期无明显变化。结论:通过形态学特征、表面标记和多向分化潜能可以鉴定体外分离培养的细胞为成人骨髓间充质干细胞;BrdU标记可用于成人骨髓间充质干细胞移植入体内后存活、生长和分化的动态示踪观察;BrdU最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72h。